Работа лаборатории: мифы, легенды, заблуждения
Всем доброго времени суток!
Подъехала новая порция информации, которую давно пережевывает мой досужий мозг.
В настоящее время уже никого не удивишь молекулярно-генетическими методами исследования всего живого или время от времени проявляющего свойства живого (если говорить, например, о вирусах). Особенно широко молекулярно-генетические методы используются в практике современных медико-биологических исследований.
Наиболее распространены технологии, основанные на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). В пандемию COVID-19 с методом ПЦР в той или иной степени познакомился, пожалуй, каждый мало-мальски социально активный гражданин нашей Необъятной Родины, если ему вдруг взблаживалось куда-либо переместиться в пространстве за пределы своего ограниченного ковидными запретами ареала.
Рассказывать о сути молекулярно-генетических методов не буду, ибо этой информации пруд пруди в сети. Любой желающий может найти, что собственно такое ПЦР, праймеры, полимераза, dNTP, амплификация, обратная транскрипция и т.д., и т.п.
Если бы вела устный диалог, то сейчас спросила бы:
-Как Вы думаете, ЧТО нужно, и КАКОЕ ВРЕМЯ нужно для проведения молекулярно-генетического исследования?
В этих двух вопросах кроется вся суть сегодняшнего моего повествования.
В далеком 2013 мне посчастливилось увидеть (будучи в гостях) отрывок «шедеврального» с точки зрения молекулярной биологии сериала под названием «СЛЕД». То, что я увидела на экране вызвало у меня (скромного лабораторного работника) бурю эмоций: началось с отрывистых смешков, которые через 30 секунд (плюс-минус 5 секунд) перешли в дикий ржач.
Итак, что же я увидела: блондинка в кудрях, в макияже, в белом (нараспашку) халате, в блузке с экстравагантным декольте держит в руках пробирку (объемом приблизительно 10-15 миллилитров), затем она ставит эту пробирку в центрифугу (одну единственную пробирку в центрифугу!!!!!!!), захлопывает крышку несчастного прибора, нажимает пальчиком с великолепным маникюром кнопочку, поворачивается к компьютеру, быстро-быстро клацает этим же маникюром по клавиатуре и… вуа-ля… монитор выдает: «100% совпадение»!!!
В серии речь шла о чем-то типа выявления генетического сходства образцов с места преступления и образцов подозреваемого. Т.е. у ФЭС (Федеральная экспертная служба – в сериале это вымышленная служба, которая раскрывает самые замысловатые и не раскрываемые преступления) были образцы ДНК с места преступления, а в лабораторию принесли образец ДНК подозреваемого, и вот эта кудрявая блондинка за 2 минуты выявила 100% совпадение образцов просто сунув образец подозреваемого (ватную палку) в пробирку, а пробирку в центрифугу!!! К сожалению, в 33 сезонах не смогла найти именно этот отрывок, но отрывки видео, что здесь привела, отражают суть.
Кто из коллег сейчас читает этот текст, думаю, как минимум улыбнулись. А для тех, кто не в теме сейчас поясню. Внешний вид актрисы и ее одежда совсем не подходят для настоящей молекулярно-генетической лаборатории, да и для любой другой лаборатории хоть немного соблюдающей правила биологической безопасности и работы с генетическим материалом (фото №1 – картинки которые мы видим на экране, а №2 – как должно быть в реале). Но это хотя бы понятно, что для красивой картинки и рейтинга сериала правилами можно пренебречь, чтобы зрителю нравилось в целом действо на экране.
Однако попрать все стадии манипуляций с образцами перед получением того самого результата «100% совпадение» — это слишком!!! По мне так лучше бы сценаристы сделали ход конем, и эта великолепная блондиночка не ставила пробирку в центрифугу (кстати говоря, неуравновешенную второй пробиркой и после включения непременно отплясывающей бы жигу по столешне, ну или на крайняк выдавшей бы ошибку), а сказала принесшему материал следователю: «Уважаемый, приходите за результатом через …надцать часиков». Это было бы более правдоподобно. Но кино есть кино и остаются на совести режиссера и сценариста все эти ляпы с таймингом исследований, разбалансированными роторами центрифуг (хотя, надо отметить, что к 21 сезону пробирки в «волшебную» центрифугу стали ставить правильно – видео №2), обустройством лаборатории с микроскопами и расставленными на всех доступных поверхностях колбами с разноцветными жидкостями непонятного назначения. Обыватели, насмотревшись такого чУдного кино, думают, что все легко, просто и главное капец как быстро в лабораторной работе.
Какже все происходит на самом деле и какие стадии проходит материал, например, от человека – клинический материал (сыворотка крови, мазок ректальный и т.п.), предназначающийся для молекулярно-генетических исследований, например, для ПЦР на наличие РНК или ДНК какого-либо вируса или бактерии?
Во-первых, необходимо кодирование поступивших на исследование проб, т.е. каждой пробе присваивается свой идентификационный номер или штрих-код для обезличивания, чтобы выполняющий исследование не знал, с каким материалом работает, и не имел личной заинтересованности в получении ложноположительного, или ложноотрицательного результата. Эта стадия может занимать от нескольких минут до нескольких часов в зависимости от количества образцов материала, поступающих на исследование и количества сотрудников, занимающихся их обработкой.
Во-вторых, проба проходит стадию выделения всего генетического материала, в ней содержащегося. Эта стадия состоит из нескольких этапов. На первом этапе – этапе лизиса (после которого проба считается обеззараженной) происходит разрушение всех структур, препятствующих выходу ДНК/РНК в раствор. Далее следует несколько этапов, и они отличаются, в зависимости от набора реагентов используемого для выделения генетического материала. Различия наборов заключаются в способе фиксации генетического материала на различных носителях (колонках, магнитных частицах, каком-либо преципитирующем агенте, например, очищенном гликогене). Затем следуют пара-тройка отмывок, в результате чего удаляются белки, жирки и углеводы, ингибирующие (угнетающие) ПЦР. После этого следует этап сушки. На этом этапе проба избавляется от остатков отмывочных растворов (чаще всего это спирты различной концентрации и ацетон). Завершает стадию выделения этап элюции. На этом этапе очищенная ДНК/РНК переводится в раствор с помощью смывания с субстрата элюэнтом (в его роли может выступать суперочищенная вода, свободная от нуклеаз). Время,необходимое для этапа выделения, колеблется от 30-40 минут до 1,5-2 часов (если речь идет, например, о работе с ДНК-содержащими вирусами, один только этап обеззараживания которых занимает 30-40 минут) и зависит от того, какой набор реагентов используется для выделения ДНК/РНК и каким способом проводится этап выделения – ручным, или с помощью специальной станции для выделения нуклеиновых кислот (на фото №3 показано как выглядит рабочее место для выделения нуклеиновых кислот, а на фото №4 – один из многочисленных вариантов автоматических станций для выделения НК).
В-третьих, при работе с РНК-содержащим возбудителем может потребоваться этап обратной транскрипции (ОТ), если тест-система не предполагает его в программе амплификации и наборе реагентов. Этот этап занимает обычно 35-60 минут, учитывая подготовку реагентики, внесение образцов и саму реакцию ОТ в приборе, которая обычно длиться 15-30 минут.
В-четвертых, мы наконец-то добрались до самой реакции ПЦР. Для проведения ПЦР необходимо подготовить реакционную смесь, внести ее в пробирки, а в пробирки с подготовленной реакционной смесью внести соответствующие пробы и контрольные образцы, а только затем поставить эти пробирки (объемом 0,2 мкл, но никак не 15 мл) и не в центрифугу, а в амплификатор (фото №5), он же термоциклер — прибор, обеспечивающий периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C, который, кстати, если амплификатор роторного типа, то напоминает центрифугу, но чаще используются амплификаторы планшетного типа. В зависимости от того, на какую инфекцию мы работаем, необходимо разное количество времени на циклическое нагревание и охлаждение пробирок с ПЦР-смесью и внесенными в нее пробами. То есть, программа амплификации не одна на все случаи жизни. Есть короткие программы, например минут 40, а есть очень длинные 2,5-3 часа, а иногда и более (особенно если работаешь с экспериментальными наборами реагентов, а ПЦР, например, двухраундовая).
После окончания амплификации наступает этап учета результатов, а потом — этап оформления протоколов. От того, насколько эта последняя процедура налажена и автоматизирована, зависит скорость получения результатов пациентом с момента окончания исследования. Открою секрет, что если этот этап хромает, то скорость выдачи результата может увеличиваться в разы. Например, само исследование от момента поступления пробы в лабу до учета результата занимает 4,5-5 часов, а результат на руки пациент может получить через сутки-трое.
Устали читать? А это только про ПЦР и то совсем чуть-чуть)))
Если говорить о секвенировании (получении информации о нуклеотидных последовательностях ДНК или РНК – та самая «расшифровка»), например, при фрагментном секвенировании по методу Сенгера, то после этапов выделения нуклеиновых кислот, ОТ (если мы про РНК) и ПЦР следует еще этап очистки продуктов амплификации, затем — проведение реакции сиквенса, снова очистка, денатурация, а уж потом загрузка в секвенатор (прибор для секвенирования). Эти этапы могут отнять у исследователя еще день-два жизни.
В зависимости от скорости работы секвенатора, количества проб и длины читаемых фрагментов, время от загрузки секвенатора до получения результата может колебаться от нескольких часов до суток, а то и более.
Для высокопроизводительного (полногеномного) секвенирования (NGS) используются совершенно иные протоколы, включающие помимо этапов выделения и очистки генетического материала, например, баркодирование. Время секвенирования тоже может быть сильно дольше. Но углубляться в эти дебри не буду, и так много наваяла.
После получения данных с секвенатора (любого), следует этап биоинформатической обработки данных. Этот этап тоже занимает разное время (от нескольких минут до нескольких недель, а то и совсем подвисает до неопределенного момента, т.к. в настоящее время существует огромное количество нерасшифрованных геномов, полученных с помощью NGS) и зависит от способа секвенирования, количества полученных данных, их качества, профессионализма биоинформатика, производительности компа на котором обрабатываются данные.
Теперь касаемо оборудования, требующегося для проведения молекулярно-генетических исследований. Если мы говорим о работе с пробами, содержащими патогенную микрофлору, то лаборатория должна иметь лицензию и санитарно-эпидемиологическое заключение на работу с соответствующей группой патогенности и быть оснащена боксами биологической безопасности (в простонародье – ламинарами), соответствующими уровню патогенности материала, с которым разрешены работы.
Для обеспечения чистоты исследований, чтобы пробы не контаминировались (загрязнялись), особенно это касается криминалистики и ПЦР-лабораторий, выполняющих диагностические исследования материала от людей, должны быть соблюдены условия поточности и разделения зон проведения исследований, т.е. отбирать образцы, проводить с ними манипуляции и получать результат в одном помещении (как это показывают в кино) ну никак не получится. Также одной «волшебной» центрифуги из сериала «След» явно сильно недостаточно для работы.
В любой уважающей себя лаборатории конечно же есть центрифуги и их много: низкоскоростные, высокоскоростные, без охлаждения и с охлаждением, со сменными роторами или адапторами под различные емкости (фальконы, пробирки, плашки). Однако, помимо центрифуг есть еще термостаты, амплификаторы, секвенаторы и куча оборудования для проверки пригодности проб для секвенирования (начиная с камер и блоков для электрофореза, заканчивая приборами для измерения концентрации нуклеиновых кислот в пробе).
Резюмируя приведенную выше инфу, хочу сказать: не верьте тому, что показывают в сериалах. Работа в лаборатории сильно отличается от того, что вы видите на экране. Зачастую лабораторщикам приходится функционировать в условиях «на грани». Например, при эпидемиях, пандемиях или на вспышках различных инфекций.
На этом завершу свое повествование. Всем добра, интересных и приятных событий в жизни, чтобы не хватало времени на просмотр ТВ.
Спасибо за внимание и до новых букв)))
Пы.сы.: сама сериалы, в том числе «След», не смотрю (времени катастрофически не хватает). Однажды обсуждали с коллегами методы работы, и я рассказала о своих воспоминаниях 2013 года, оказалось, что сериал востребован и теперь коллеги мне присылают инфу по сериям и на какой минуте тот или иной ляп. За что им огромное спасибо!!! Без этой информации иллюстрировать данный текст было бы крайне сложно.
Пы.сы. №2: Вчера уже хотела публиковать заметку, но мои любимые коллеги не унимаются и скинули мне наводку на сериал «Точка ноль»… В итоге смотрела пол ночи это произведение кинематографического искусства с карандашом и блокнотом, но об этом нужен отдельный пост, возможно даже не один, если вам интересно конечно же.
#Генетика@inbioreactor
#Биология@inbioreactor
#Заметка@inbioreactor
Текст: #Лисицкая@inbioreactor
Редактура: #Самсонова@inbioreactor